文獻(xiàn)分享 | 肺癌腫瘤內(nèi)細(xì)菌：分離、培養(yǎng)與體外功能驗(yàn)證

傳統(tǒng)肺癌微生物組研究高度依賴16S rDNA測序等非培養(yǎng)技術(shù)，難以獲得活菌株開展功能驗(yàn)證。本研究整合培養(yǎng)組學(xué) + 16S rDNA 高通量測序 + 體外功能實(shí)驗(yàn)，首次從臨床肺癌組織中分離可培養(yǎng)菌株，并證實(shí)其促腫瘤增殖、促炎的關(guān)鍵作用，為肺癌微生物機(jī)制研究與靶向干預(yù)提供核心實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

發(fā)表期刊：BMC Microbiology（IF=4.2）

發(fā)表時(shí)間：2025年8月

DOI：10.1186/s12866-025-04237-4

核心技術(shù)：培養(yǎng)組學(xué) | 16S rDNA 測序 |體外功能驗(yàn)證

一、研究目的

1.用培養(yǎng)組學(xué) + 16S rDNA測序，鑒定肺癌組織駐留微生物；

2.體外驗(yàn)證分離得到菌株功能，明確其與肺癌發(fā)展的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

二、實(shí)驗(yàn)方法  

 

 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與培養(yǎng)組學(xué)方法、流程總結(jié)

1.樣本收集與處理：選取未手術(shù)/未放化療的NSCLC患者，術(shù)中取腫瘤組織1-4cm³。一份用于細(xì)菌培養(yǎng)組學(xué)分析，新鮮樣本冰上1h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室處理；另一份-80℃保存，用于16S rDNA測序。同時(shí)設(shè)置環(huán)境和培養(yǎng)對(duì)照，排除污染干擾。

2. 微生物分析方法

1）16S rDNA測序分析：擴(kuò)增16S rRNA的V3-V4區(qū)，通過測序平臺(tái)進(jìn)行雙端測序；經(jīng)聚類OTU（97%相似性）、Silva數(shù)據(jù)庫物種注釋，分析肺癌組織微生物的群落組成。

2）培養(yǎng)組學(xué)分析：將腫瘤組織勻漿后預(yù)培養(yǎng)于5%血培養(yǎng)瓶，分別在1、3、6天取樣，梯度稀釋后接種于5%綿羊血哥倫比亞瓊脂，同時(shí)進(jìn)行有氧培養(yǎng)（37℃，24h）和厭氧培養(yǎng)（37℃，72h）；對(duì)菌落進(jìn)行鑒定，對(duì)鑒定結(jié)果不佳的菌株進(jìn)行16S rRNA全長測序。

3. 體外功能驗(yàn)證

1）菌株篩選：選取4種葡萄球菌菌株（S.warneri-01、S.hominis-22、S.capitis-22、S.nepalensis-09），以健康人糞便分離的鼠李糖乳桿菌為陰性對(duì)照。

2）腫瘤細(xì)胞增殖檢測：采用RTCA（實(shí)時(shí)細(xì)胞分析）技術(shù)監(jiān)測A549肺癌細(xì)胞。

3）促炎細(xì)胞因子檢測：ELISA檢測上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子。

三、研究結(jié)果

1）培養(yǎng)組學(xué)分離肺癌組織細(xì)菌特征

18份樣本中5份培養(yǎng)陽性，細(xì)菌平均檢出率27.8%，共分離鑒定出12種細(xì)菌，葡萄球菌屬占比最高（59%）；厭氧條件下分離的菌株數(shù)量多于有氧條件，初始培養(yǎng)階段為菌株分離的最佳窗口期。

2）16S rDNA測序的微生物組成

門水平的變形菌門、厚壁菌門、放線菌門占主導(dǎo)；樣本間個(gè)體差異極大，腫瘤微環(huán)境菌群高度異質(zhì)性。

16SrRNA測序鑒定的肺癌組織細(xì)菌組成分析

A.18例肺癌樣本在門水平的分類組成；B.18例肺癌樣本在屬水平的分類組成

3）16S rDNA 測序與培養(yǎng)組學(xué)檢測方法的對(duì)比

培養(yǎng)組學(xué)分離的12種細(xì)菌分屬厚壁菌門（67%）、放線菌門（25%）、變形菌門（8%），與測序的菌門組成趨勢一致；但僅芽孢桿菌屬能同時(shí)通過兩種方法檢出，其余菌屬存在明顯檢測差異，提示腫瘤微生物的培養(yǎng)難度較高。

 

16S rDNA 測序與培養(yǎng)組學(xué)方法的比較

A 5例培養(yǎng)陽性肺癌樣本中豐度前10菌門的百分比直方圖；

B 5例培養(yǎng)陽性肺癌樣本中豐度前10菌屬的百分比直方圖；

C 5例肺癌樣本中分離的12種細(xì)菌按門與屬劃分的百分比構(gòu)成；

D 18例樣本測序豐度前10菌屬與5例樣本可分離菌屬的對(duì)比

4. 體外功能驗(yàn)證結(jié)果

體外增殖與促炎作用檢測

A實(shí)時(shí)細(xì)胞分析檢測不同葡萄球菌株對(duì)肺癌細(xì)胞系增殖的促進(jìn)作用；

B刺激148小時(shí)后細(xì)胞指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；C四株菌與THP-1共培養(yǎng)上清中TNF-α含量；

D四株菌與THP-1共培養(yǎng)上清中IL-1β含量；E加熱組與未加熱組四株菌上清中TNF-α含量；

F加熱組與未加熱組四株菌上清中IL-1β含量。

本研究聯(lián)用測序+培養(yǎng)組學(xué)分析肺癌組織菌群：測序可揭示微生物組成，培養(yǎng)組學(xué)既能部分驗(yàn)證測序結(jié)果，更能獲得可用于后續(xù)研究的活菌；研究首次通過培養(yǎng)法從肺癌組織分離菌株并完成體外功能驗(yàn)證。

微基生物可提供腫瘤微生物樣本處理、有氧/厭氧分離培養(yǎng)、16S rDNA測序與菌株精準(zhǔn)鑒定、細(xì)菌培養(yǎng)上清代謝物分析等服務(wù)，并圍繞腫瘤微生物研究特點(diǎn)，提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本采集、方法選擇及結(jié)果解析的全流程技術(shù)咨詢，助力提升菌株分離效率與功能驗(yàn)證準(zhǔn)確性。